遗传毒性试验中细胞计数问题解决方案

发布日期:2019-06-28 09:56:00浏览次数:133

医疗器械遗传毒性试验方法的应用现状

经过多年的发展,遗传毒性试验包括了原核生物、真核生物、体内和体外试验等多种体系。目前国内医疗器械毒性评价方法主要依据GB/T 16886.5-2017 /ISO 10993-5: 2009。目前关于遗传毒性评价方法都只是方法性的概述,各试验方法并没有建立行标,实验室之间的方法虽然大致相似,但具体操作甚至某些试验参数仍存在差异,不利实验室之间的结果对比。

本文主要以小鼠淋巴瘤细胞突变试验中细胞质量控制的细胞计数问题为例进行阐述。

小数淋巴瘤细胞突变试验

小鼠淋巴瘤细胞突变试验简称小鼠淋巴瘤试验(the Mouse Lymphoma Assay,MLA),是一项在国际上较为广泛采用的遗传毒性致突变常规试验。MLA是以抗药性的出现作为观察突变指标,不仅能检测出点突变等小基因突变,对染色体水平以及大的缺失等位基因的变化也能检测到。

由于很多致癌剂的生物转化是依赖于细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的,其中大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统。该实验中细胞样本中加入适量的S9蛋白溶液,但是S9蛋白有时候会容易形成蛋白沉淀,导致细胞计数困难。

常用的计数方法是台盼蓝染色法,但是由于台盼蓝染色特异性不是特别好,且对对蛋白有一定的亲和性,所以对于加入S9蛋白溶液的小鼠淋巴瘤细胞计数会产生一些影响。所以本次实验,我们针对这种细胞计数做一个对比研究,期望找到更好的计数方法来解决客户的困难。

含S9蛋白溶液的小鼠淋巴瘤细胞计数

实验方案:I5178小鼠淋巴瘤细胞中添加适量S9蛋白溶液共培养。取出适量细胞同时使用台盼蓝和AOPI两种方法进行浓度及活率计数。两种方法计数结果如表1和表2及图1所示。检测设备为Countstar Rigel S2。

样本编号

总细胞浓度

活细胞浓度

活率%

复孔1

6.49E+05

5.88E+05

90.62

复孔2

6.23E+05

5.47E+05

87.82

复孔3

6.20E+05

5.37E+05

86.72

平均值

6.31E+05

5.57E+05

88.4

CV%

2.53%

4.85%

2.28%

表1. I5178小鼠淋巴瘤细胞台盼蓝计数结果

结论1:I5178小鼠淋巴瘤细胞台盼蓝计数结果浓度及活率重复性好,CV值均在5%以内。

样本编号

总细胞浓度

活细胞浓度

活率%

复孔1

4.17E+05

3.79E+05

90.71

复孔2

4.08E+05

3.79E+05

92.77

复孔3

4.20E+05

3.95E+05

93.95

复孔4

4.47E+05

4.09E+05

91.4

平均值

4.23E+05

3.91E+05

92.2

CV%

3.97%

3.70%

1.57%

表2. I5178小鼠淋巴瘤细胞AOPI计数结果

结论2:I5178小鼠淋巴瘤细胞AOPI计数结果浓度及活率重复性好,CV值均在5%以内。对比表1的结果发现,AOPI计数细胞浓度高于台盼蓝计数,细胞活率低于台盼蓝计数。具体原因根据细胞图片进行分析,如图1。

图1. I5178小鼠淋巴瘤细胞台盼蓝及AOPI计数结果图

结论3:I5178小鼠淋巴瘤细胞台盼蓝计数结果图片中,有很多台盼蓝着色的团状物,无法辨别是死细胞或者S9蛋白沉淀,同时有一些性质区别于淋巴瘤细胞的长条状物质无法判断为细胞或S9蛋白。AOPI计数结果图片中,明场图片可以明显看出S9蛋白沉淀,AOPI染色图片死活细胞区分清晰,且S9蛋白不被AOPI染色,可以有效避免S9蛋白干扰。

结论

1、对于含有S9蛋白沉淀的细胞样本,使用Countstar Rigel细胞分析仪可以同时进行台盼蓝计数及AOPI计数,并得到稳定重复性好的数据;

2、对于含有S9蛋白沉淀的细胞样本,台盼蓝计数结果中,有部分台盼蓝染色的物质无法判断是死细胞或S9细胞沉淀,也有部分形态区别于淋巴瘤细胞的疑似杂质的样本,这些杂质对细胞浓度及活率影响比较大。用AOPI荧光染料特异性更好,该染色方法可有效避免S9蛋白及其他非细胞杂质的干扰。

(PS: 仅限于研究用途, 不可用于诊断操作)