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双荧光法分析血液和原代细胞

摘要

血液、新鲜分离的原代细胞或培养的细胞可能会含有杂质、红细胞或细胞碎片等干扰颗粒,这使得人们无法分析目标细胞。基于双荧光方法分析的Countstar® Rigel可以排除细胞碎片、杂质、干扰颗粒以及血小板等尺寸过小的物质,从而得到高度准确的结果。

介绍

  • AO/PI双荧光活率计数
  • 全血中白细胞(WBC)的分析
  • 外周血单个核细胞(PBMC)的浓度和活率分析

AO/PI双荧光活率计数

图1 Countstar® FL AO/PI双荧光活率计数操作步骤

吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)是细胞核的核酸结合染料。因此AO/PI双荧光分析方法能够排除细胞碎片、杂质、干扰颗粒以及红细胞等尺寸过小的物质,从而得到高度准确的结果。

全血中白细胞(WBC)分析

图2 Countstar® FL拍摄的全血样本图像

全血中白细胞的分析是临床实验室或血库中的常规检测。白细胞的浓度和活率是血液储存质量控制的重要指标。基于AO/PI双荧光方法的Countstar® FL可以准确区分细胞的死活状态,并能够排除红细胞的干扰。

全血中PBMC的分析

简介

全血中白细胞的分析是临床实验室或免疫学研究的常见的检测实验。白细胞的浓度和活率是血液质量控制的重要指标。除白细胞外,全血中含有大量血小板、红细胞或细胞碎片,这使得人们无法直接在显微镜或明场细胞计数仪下进行全血分析。常规的白细胞计数方法包括红细胞溶解过程,十分耗费时间。 AO/PI双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。细胞染色液由吖啶橙(绿色荧光核酸染料)和碘化丙锭(红色荧光核酸染料)混合而成。碘化丙锭(PI)不具有膜透过性,只能进入细胞膜受损的细胞,而吖啶橙能够穿过所有的细胞群体。当两种染料同时存在于细胞核中,碘化丙锭通过荧光共振能量转移(FRET)引起吖啶橙荧光的减少。因此,在Countstar® Rigel系统中,具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞,而具有受损细胞膜的有核细胞染红色荧光并被计为死细胞。 对于许多复杂细胞群体的特征分析,Countstar® FL是一台理想的分析仪器,它能够快速分析全血中的白细胞。

实验过程

  • 1. 取20µL血液样品并用180µL PBS稀释。
  • 2. 取12µL AO/PI染色液加入12µL样品中,用移液器轻轻混合;
  • 3. 将20µL混合溶液吸入细胞计数板;
  • 4. 让细胞在计数板内静置约1分钟;
  • 5. 将计数板放入Countstar ® FL仪器;
  • 6. 选择“AO/PI活率”测定,然后输入此样品的样品ID。
  • 7. 选择稀释比率和细胞类型,点击“运行”开始测试。

警告 : AO和PI是潜在的致癌物。建议操作人员佩戴个人防护装备(PPE),以避免直接接触皮肤和眼睛。

结果

1、全血的明场图像

在全血的明场视野图像中,WBC在红细胞中不可见。

2、全血的荧光图像

AO和PI染料都能对细胞核中的DNA染色。因此,血小板、红细胞或细胞碎片的存在不会影响白细胞浓度和活率结果。活的白细胞(绿色)和死的白细胞(红色)很容易在荧光图像中看到。

图2 全血的荧光图像 (A)AO通道的图像;(B)PI通道的图像;(C)AO/PI通道的融合图像

3、白细胞的浓度和活率

Countstar® Rigel软件自动对每个样品的三个视野进行细胞计数,并计算白细胞总数(1202)、浓度(1.83x106细胞/ ml)和活率(82.04%)的平均值。 全血图像和数据可以以PDF、图片或Excel格式轻松导出进行其他分析或数据归档。

图3 Countstar® Rigel 软件截图

外周血单个核细胞(PBMC)的浓度和活率分析

图3 Countstar® Rigel拍摄的PBMC的明场图像和荧光图像
AO/PI双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。因此,在Countstar® Rigel系统中,具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞,而具有受损细胞膜的有核细胞染红色荧光并被计为死细胞。红细胞、血小板和碎片等无核物质不发荧光并被Countstar® Rigel系统忽略。

AO/PI双荧光分析测定PBMC的浓度和活率

简介

通常使用密度梯度离心法从全血中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。 PBMCs由淋巴细胞(T细胞,B细胞,NK细胞)和单核细胞组成,常用于免疫学、细胞治疗、传染病和疫苗开发领域。 监测和分析PBMC的活率和浓度对临床实验室、基础医学科学研究和免疫细胞制备至关重要。

图1 密度梯度离心法从新鲜血液中分离出PBMC

AO/PI双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。细胞染色液由吖啶橙(绿色荧光核酸染料)和碘化丙锭(红色荧光核酸染料)混合而成。碘化丙锭(PI)不具有膜透过性,只能进入细胞膜受损的细胞,而吖啶橙能够穿过所有的细胞群体。当两种染料同时存在于细胞核中,碘化丙锭能够通过荧光共振能量转移(FRET)引起吖啶橙荧光的减少。因此,在Countstar® FL系统中,具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞,而有受损细胞膜的有核细胞仅染红色荧光并被计为死细胞。红细胞、血小板和碎片等无核物质不发荧光并被Countstar® Rigel系统忽略。

实验步骤

  • 1. 用PBS将PBMC样品稀释成5种不同浓度;
  • 2. 将12µL AO/PI染色液加入到12µL样品中,用移液器轻轻混合;
  • 3. 将20µL混合物吸入细胞计数板;
  • 4. 让细胞在计数板上静置约1分钟;
  • 5. 将计数板放入Countstar® FL仪器;
  • 6. 选择“AO/PI活率”测定,然后由Countstar® FL进行测试。

警告 : AO和PI是潜在的致癌物。建议操作人员佩戴个人防护装备(PPE),以避免直接接触皮肤和眼睛。

结果

图2 PBMC的明场和荧光图像
1、PBMC的明场和荧光图像
AO和PI染料都能对细胞核中的DNA染色。因此,血小板、红细胞或细胞碎片的存在不会影响PBMCs的浓度和活率结果。 活细胞、死细胞和细胞碎片很容易在Countstar® FL拍摄的图像中被区别出。

2、PBMC的浓度和活率
PBMC样品分别用PBS进行2倍、4倍、8倍和16倍稀释,然后将这些样品与AO/PI染色液混合孵育并通过Countstar® FL进行分析。PBMC的浓度和活率结果如下图所示: 图3 5个不同PBMC样品的浓度和活率。(a)不同样本的活率分布图。(b)不同样本之间总细胞浓度的线性关系。(c)不同样本之间活细胞浓度的线性关系。