免疫细胞治疗 干细胞治疗 工业生产 血液和原代细胞研究 细胞系计数 癌细胞研究 藻类研究 酵母细胞分析仪

背景

细胞疗法无疑是引领生物医学未来的新希望,但人类细胞在医学中的应用并不是一个新概念。在过去的几十年里,细胞疗法取得了长足的进步,细胞治疗本身不再是一个简单的细胞收集和回灌。 现在通常需要对细胞 Countstar产品已被国内外许多领先细胞治疗的公司所接受,我们可以帮助我们的客户建立一个稳定可靠的细胞浓度活率监测系统。

细胞浓度和活率检测中面临的挑战

在临床CAR-T细胞制造的每个环节中,必须精确确定细胞活率和细胞浓度。新鲜分离的原代细胞或培养细胞可能含有杂质,几种细胞类型或干扰颗粒如细胞碎片,这将使得不可能分析目标的细胞。

A0/PI双荧光法浓度活率检测

吖啶橙和碘化丙啶是可以和细胞核核酸结合的荧光染料。AO可以穿透活细胞和死细胞对细胞核进行染色并发出绿色荧光,PI进入死细胞对细胞和进行染色并发出红色荧光。因此AO/PI为细胞核染料,可以准确区分活细胞与死细胞,而且可以排除杂质或者非特异细胞的干扰,进行精准的浓度活率检测。

AO/PI双荧光分析测定PBMC的浓度和活率

简介

通常使用密度梯度离心法从全血中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。 PBMCs由淋巴细胞(T细胞,B细胞,NK细胞)和单核细胞组成,常用于免疫学、细胞治疗、传染病和疫苗开发领域。 监测和分析PBMC的活率和浓度对临床实验室、基础医学科学研究和免疫细胞制备至关重要。 AO/PI双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。细胞染色液由吖啶橙(绿色荧光核酸染料)和碘化丙锭(红色荧光核酸染料)混合而成。碘化丙锭(PI)不具有膜透过性,只能进入细胞膜受损的细胞,而吖啶橙能够穿过所有的细胞群体。当两种染料同时存在于细胞核中,碘化丙锭能够通过荧光共振能量转移(FRET)引起吖啶橙荧光的减少。因此,在Countstar® FL系统中,具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞,而有受损细胞膜的有核细胞仅染红色荧光并被计为死细胞。红细胞、血小板和碎片等无核物质不发荧光并被Countstar® Rigel系统忽略。

实验步骤

  • 用PBS将PBMC样品稀释成5种不同浓度;
  • 将12µL AO/PI染色液加入到12µL样品中,用移液器轻轻混合;
  • 将20µL混合物吸入细胞计数板;
  • 让细胞在计数板上静置约1分钟;
  • 将计数板放入Countstar® FL仪器;
  • 选择“AO/PI活率”测定,然后由Countstar® FL进行测试。

警告 : AO和PI是潜在的致癌物。建议操作人员佩戴个人防护装备(PPE),以避免直接接触皮肤和眼睛。

结果

1、PBMC的明场和荧光图像

AO和PI染料都能对细胞核中的DNA染色。因此,血小板、红细胞或细胞碎片的存在不会影响PBMCs的浓度和活率结果。 活细胞、死细胞和细胞碎片很容易在Countstar® FL拍摄的图像中被区别出(图2)。

2、PBMC的浓度和活率

PBMC样品分别用PBS进行2倍、4倍、8倍和16倍稀释,然后将这些样品与AO/PI染色液混合孵育并通过Countstar® FL进行分析。PBMC的浓度和活率结果如下图所示:

T/NK 细胞介导的细胞毒性
CAR-T疗法,用基因工程的方法对T细胞进行基因改造以产生可以直接和靶标肿瘤细胞结合并攻击的CAR-T细胞。

对靶标细胞用无毒的无放射性的钙黄绿素进行标记(或者GFP转染标记),我们可以观察CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤效应。活的肿瘤细胞会含有钙黄绿素或者GFP,死的肿瘤细胞不含有钙黄绿素或者GFP。Hoechst33342被用来染色所有的细胞(包含T细胞和肿瘤细胞),PI用来染色所有的死细胞(包含T细胞和肿瘤细胞)。这种染色策略可以让我们对细胞进行精准的区分。

E:T比率对K562的细胞毒性研究

随着E:T比率增加,所得荧光图像显示Hoechst + CFSE + PI +靶细胞的增加 图 3 K562靶细胞与效应细胞混合培养3h 后,Hoechst 33342,CFSE,PI染色的荧光图像

检测结果一致性和符合GMP法规

传统的细胞计数中一个常见问题是用户、部门和站点之间存在数据差异。 而所有Countstar 分析仪在不同的地点或生产地点计数结果是相同。 这是因为在质量控制过程中,每台仪器都必须根据标准仪器进行校准。
传统的细胞计数中一个常见问题是用户、部门和站点之间存在数据差异。 而所有Countstar 分析仪在不同的地点或生产地点计数结果是相同。 这是因为在质量控制过程中,每台仪器都必须根据标准仪器进行校准。
中央数据库允许用户保存所有数据,如仪器测试报告,细胞样本报告和测试仪电子签名,安全永久。

Countstar产品-合规性

开发符合GMP规范的细胞分析设备,推动国内细胞治疗相关行业的产业化发展。

Countstar软件系统的数据管理和控制性能完全符合FDA 21 CFR Part11

IQ/OQ/PQ 认证服务和标准微珠