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干细胞治疗中细胞活率、形态和表型的测定

间充质干细胞是来源于中胚层的一类多能干细胞,因具有自我复制更新和多向分化的特点,其在医学不同的治疗领域具有很大的潜力。间充质干细胞具有独特的免疫表型和免疫调节能力。因此,间充质干细胞被广泛应用于干细胞移植、组织工程和器官移植。除此之外,在一系列基础和临床研究实验中,间充质干细胞被用作组织工程中理想的种子细胞。

摘要

Countstar® Rigel可以在干细胞的制备和分化过程中监测其浓度、活率、凋亡和表型特征(及其变化),同时可以根据明场和荧光图像记录获取整个细胞质量控制过程中的细胞形态信息,Countstar® FL为干细胞的质量控制提供了一种快速、精密和可靠的监测方法。

目录

  • 再生医学中间充质干细胞(MSC)的活率监测
  • 运输后监测MSC的形态变化
  • AdMSCs细胞表型的鉴定
  • 利用Annexin-V- FITC和7-ADD快速检测MSCs的凋亡

再生医学中MSCs浓度和活率的监测

图1监测细胞疗法中使用的间充质干细胞(MSCs)的活率和数量。

干细胞治疗是再生细胞治疗中最有希望的治疗方法之一。 从收获MSC到治疗,监测MSC的浓度和活率在质量控制中起着关键作用(图1)。 Countstar® Rigel为监测MSC的浓度和活率提供了一种快速、精密、可靠的方法。

再生医学中MSCs浓度和活率的监测

简介

AO/PI双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。细胞染色液由吖啶橙(绿色荧光核酸染料)和碘化丙锭(红色荧光核酸染料)混合而成。碘化丙锭(PI)不具有膜透过性,只能进入细胞膜受损的细胞,而吖啶橙能够穿过所有的细胞群体。当两种染料同时存在于细胞核中,碘化丙锭能够通过荧光共振能量转移(FRET)引起吖啶橙荧光的减少。因此,在Countstar® Rigel系统中,具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞,而具有受损细胞膜的有核细胞染红色荧光并被计为死细胞。红细胞、血小板和碎片等无核物质不发荧光并被Countstar® Rigel系统忽略。

干细胞治疗的过程

图2监测细胞疗法中使用的间充质干细胞(MSCs)的活率和数量

对比AO/PI和台盼蓝分析测定MSC的活率

图2 (A)MSC分别经AO/PI和台盼蓝分析后的图像 (B)运输前后AO/PI和台盼蓝分析结果的比较。

由于细胞折射率的变化,台盼蓝染色不明显,在运输后难以确定细胞的活率。而双色荧光允许染色活的和死的有核细胞,即使存在碎片、血小板和红细胞也能产生准确的活率结果。

运输后对MSC形态变化的监测

图3 运输后MSC的形态变化 Countstar® FL 同时可以测定细胞的直径和聚团情况。AdMSCs的直径在运输前后有很大的变化,运输前直径是19µm,但运输后直径增大至21µm。运输前的聚团率为20%,运输后增大至25%。从Countstar® FL拍摄的图像可以看出,运输后,AdMSCs的表型发生了巨大变化

AdMSCs 细胞表型的鉴定

目前,监测间充质干细胞质量保证的最低标准鉴定测试程序已被列入国际细胞治疗学会(ISCT)的声明中,该声明在2006年确定。

通过Countstar® FL确定AdMSCs的免疫表型

简介

免疫表型分析是细胞相关研究领域的典型实验,用于各种疾病诊断(自身免疫疾病,免疫缺陷疾病,肿瘤诊断,止血,过敏性疾病等等)和疾病病理学,同时它也被用来测试各种细胞疾病研究中的细胞质量。流式细胞仪和荧光显微镜是细胞疾病研究所用于免疫表型分析的常规分析方法,但这些分析方法仅能提供图像或数据系列,因此这些分析方法可能不符合监管机构严格的审批要求。

鉴定AdMSCs的免疫表型

分别用不同的抗体(CD29,CD34,CD45,CD56,CD73,CD105和HLADR)孵育AdMSCs,通过Countstar® Rigel测定AdMSCs的免疫表型。CD105的结果见图1。 图1 AdMSCs免疫表型的鉴定(A)AdMSCs的明场和荧光图像; (B)Countstar® FL对AdMSCs CD Marker的检测

MSCs的质量控制——验证每个单独细胞的结果

图2 (A)Countstar® Rigel结果显示在FCS express类流式软件中,门控CD105的阳性百分比以及概览表格中单独的细胞。(B)调整门控到右侧,单细胞表的图像显示的细胞高表达CD105。(C)调整门控到左侧,单细胞表的图像显示的细胞低表达CD105。

分析运输过程中表型的变化

图3 (A)通过FCS express 5 plus软件定量分析不同样品中CD105的阳性百分比。(B)高质量的图像提供额外的形态信息。(C)通过每个单细胞的缩略图验证结果,FCS软件工具根据其不同的蛋白质表达将细胞分成不同的组。

利用Annexin-V- FITC和7-ADD快速检测MSCs的凋亡

简介

细胞凋亡可以用Annexin-V- FITC和7-ADD进行检测。磷脂酰丝氨酸(PS)通常仅见于健康细胞的质膜胞内小叶中,但在早期细胞凋亡期间,膜不对称性丧失且磷脂酰丝氨酸转位至外部小叶。 (A)MSCs凋亡检测的荧光图像 (B)通过FCS软件分析得到的MSC凋亡散点图 (C)正常细胞、凋亡细胞、坏死或极晚期凋亡细胞的百分比。