细胞周期及其检测方法
发布日期：2019-10-28 09:04:00浏览次数：5136
细胞周期及其主要事件
细胞周期是指连续分裂的细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程，正常情况下，沿着G1→S→G2→M期运转（如图1），细胞周期所经历的时间称为细胞周期时间。其四个时期的主要事件分别是：
G1期：G1期合成细胞生长所必需的各种蛋白质、糖类、脂类等，但不合成DNA。
S期：DNA合成期。新的组蛋白也是在S期合成的，真核细胞新合成的DNA立即与组蛋白结合，共同组成核小体串珠结构。
G2期：细胞核内DNA的含量已经增加一倍。其他结构物质和相关的亚细胞结构也进行了进入M期的准备。
M期：细胞分裂期。
从增殖角度来看，细胞可以分为3类：
①连续分裂细胞（周期中细胞）；在细胞周期中连续运转。
②静止期细胞（G0期细胞）：暂时脱离细胞周期，不进行增殖，在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞，多为暂时不分裂的休眠细胞。
细胞周期同步化
细胞周期同步化是指自然的，或经人为选择或诱导产生的细胞周期同步化，前者为自然同步化，后者为人工同步化。人工同步化分为选择同步化和诱导同步化。
（1）选择同步化：①是有丝分裂选择法，经单层培养可获得一定数量的M期细胞。单层培养于培养皿中的细胞使之处于对数期增殖，此时细胞分裂活跃，分裂指数高，分裂细胞变圆、隆起，与培养皿的粘着性降低。此法的优点是不受药物影响，同步化程度高，缺点是分离的细胞少。②是密度梯度离心法，根据不同时期的细胞在体积和重量上存在的差别进行分离，优点是简单省时，效率高，成本低，缺点是对多数种类的细胞并不适用。
（2）诱导同步化：
①DNA合成阻断法：用DNA合成抑制剂可逆地抑制DNA合成而不影响其他各时期细胞沿细胞周期运转，最终将细胞群体阻断在S期。TdR双阻断法最常用，细胞最终阻断于G1/S交界处。优点是同步化效率高，适合多数体外培养的细胞体系，缺点是诱导过程可造成细胞非均衡生长。
②中期阻断法：利用秋水仙素等抑制有丝分裂器的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期。此方法优点是操作简单，效率高，缺点是有些药物毒性相对较大
（1）同位素标记法：对测定的细胞进行脉冲标记，定时取材，利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。
（2）BrdU渗入法测定：BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计算分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
（3）流式细胞仪结合PI染色法：细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI（碘化丙啶）可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G0/G1期，S期和G2/M期，获得的流式图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。
（4）Countstar Rigel荧光细胞分析仪PI染色法检测：细胞用PI孵育后，然后在Rigel 分析仪上进行检测，导出流式数据后，在FCS软件上分析，得到周期峰图。
其实验步骤如下：
①每个样品收集约30-50万个细胞于1.5毫升离心管内；400g 离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入约500微升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
②细胞固定：加入500微升冰浴预冷60%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定1小时或更长时间。
③400g左右离心 3-5 分钟，沉淀细胞。可以残留约50微升左右的60%乙醇，以避免吸走细胞。加入约200微升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
④染色：每管细胞样品中加入100微升PI染色液（100微升染色缓冲液＋1微升PI＋0.5微升RNase A），缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。
⑤混匀细胞，上机检测（如图2）。
⑥导出流式数据，在FCS软件上进行分析。