细胞凋亡及其检测方法

发布日期：2019-08-23 10:56:00浏览次数：3165

细胞凋亡

1.细胞凋亡的概念

细胞凋亡（Cell apoptosis）是一个主动的由基因决定的细胞自动结束生命的过程，是细胞为维持内环境稳定而有序性地死亡，它涉及一系列基因的激活、表达和调控等作用，具有生理性和选择性的。

2.细胞凋亡的特征

（1）形态学变化：最初细胞体积缩小，细胞间接触消失，与周围细胞脱离；之后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜、核仁破裂，胞膜有小泡形成，胞膜结构依旧完整，最终可将凋亡细胞分割包裹成几个凋亡小体，无内容物外溢；凋亡小体可以被周围专职或非专职的吞噬细胞吞噬。

（2）生物学变化：DNA发生有控降解，片段化的DNA片段为180-200bp的整倍数；在细胞凋亡的过程中，也常有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。

3.细胞凋亡的生理意义

（1）维持多细胞生物个体发育的正常进行；

（2）保持自稳平衡；

（3）抵御外界各种因素的干扰。

细胞凋亡的检测方法

1.形态学观察

根据凋亡细胞固有的形态特征，用台盼蓝、DAPI或Giemsa染色，然后在光学显微镜下观察，或直接在电镜下观察。

2.DNA片段化检测

细胞发生凋亡时，DNA发生特征性的核小体间的断裂，产生大小不同的片段，但都是180~200bp的整数倍，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。

3.彗星电泳法

彗星电泳的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶电泳中，经裂解处理后，产生大小不同的片段，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA断裂片段，在电场中游动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式图案。

4.TUNEL测定法

即DNA断裂的原位末端标记法，细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞。

5.流式细胞分析法

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

6.Countstar Rigel 检测法

结合Annexin-V FITC和PI染色液，对细胞样品进行处理，然后在Rigel 仪器上进行检测，然后流式分析导出，在FCS类流式软件上进行分析，得到散点图结果。

其实验步骤如下：

①每个样品收集约30~50万个细胞于1.5毫升离心管内（如细胞密度为100 万个/mL，则取500微升体积悬液用于后续实验）；将细胞在400g转速条件下离心3分钟，弃上清，用200微升PBS进行重悬；用移液枪轻轻吹打混匀，400g转速条件下离心3分钟，弃上清，用 100 微升Annexin V Binding Buffer重悬；

②向细胞悬液中加入1.5微升Annexin-V-FITC染色液；

③加入4微升PI染色液；

④混匀，室温避光孵育10~15分钟；

⑤400g转速条件下离心3分钟，弃上清，用100微升Annexin V Binding Buffer进行重悬；

⑥400g转速条件下离心3分钟，弃上清，用100微升Annexin V Binding Buffer进行重悬；

⑦在30分钟内完成检测，检测之前，避光保存。吸取20微升悬液，加入细胞计数板，插入仪器样品槽里，选择“细胞凋亡”实验类型，进行检测；流式分析导出，在FCS软件上进行分析，如图1和2。

（PS: 仅限于研究用途，不可用于诊断操作）