成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要组成成分，它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的，胞体较大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，胞质弱嗜碱性，细胞核较大，呈椭圆形，染色质疏松，着色浅，核仁明显，细胞轮廓不清，具有突起。成纤维细胞能够分泌少量的细胞生长因子，也能合成和分泌胶原蛋白和弹性蛋白，生成诸如胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等细胞外基质成分。成纤维细胞容易培养，取材也非常便利，容易受基因修饰，所以它常常有不同的应用：

（1）作为基因修饰的受体细胞应用于细胞核移植、基因表达等方面；

（2）作为多种干细胞如胚胎干细胞（ES）和神经干细胞（NSC）等细胞培养的饲养层，其分泌的细胞因子可维持干细胞的未分化状态；

（3）可作为研究机体内源性逆转录病毒体外和体内感染性的细胞模型；

（4）利用成纤维细胞大量增殖的特性，可用于机体创伤修复包括一般创伤修复和骨创伤修复。

1.取材：采集机体皮肤，放入含有双抗（100U/mL青霉素和100U/mL链霉素）的无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS），反复洗涤多次，剪除毛茬，去除血污、脂肪和结缔组织，保留真皮层，用眼科剪将皮肤剪成3~4mm的碎片。

2.原代培养

a.胰酶消化法：将皮肤组织块用眼科剪剪碎后，加入适量含有0.02%EDTA的0.25%的胰酶进行消化，置于37℃水浴锅内，每隔10min左右吹打摇晃一次，30min后，用100目过滤网滤掉组织块，将细胞悬液1000g离心5min，去除上清液，用培养液重悬细胞，再次离心重悬后，调整细胞密度至1~5×10⁵个/mL，接种于75mL培养瓶内，放入37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养，每2d换液1次。细胞培养液为含10%胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM培养液。

b.组织块贴壁培养法：将细碎的组织块接种于75mL培养瓶内，均匀铺于瓶底，皮块之间相距1cm，翻转培养瓶，使瓶底向上，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养2h，使皮块略微干涸。之后，放正培养瓶，使瓶底向下，加入适量培养液，覆盖瓶底，放入培养箱内进行培养，每2d换液1次，并观察细胞贴壁情况。

3.传代培养：当细胞长到80%~90%汇合度时，开始进行传代培养。吸出培养瓶里的培养液，用已在37℃预热的无钙镁离子的PBS溶液（DPBS）里洗涤3次，去除细胞碎片和残余血清，然后用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶在37℃消化2min，观察贴壁细胞变圆时，加入含胎牛血清的培养液终止消化，并用移液器吹打，使细胞脱落，吸取细胞悬液，1000g离心5min，重悬离心2次后，调整细胞密度至1~5×10⁵个/mL，接种于培养瓶内继续培养。

4.细胞冻存：冻存液的配制比例为DMEM: FBS: DMSO=7:2:1。按照传代培养方法对细胞进行消化，离心，去上清液后，用冻存液重悬细胞，调整细胞密度为1~2×10⁶个/mL，取1mL细胞悬液置于1.8mL冻存管内，密封冻存管，并标上细胞类型和冻存时间，将冻存管在4℃冰箱放置30min后，移入-20℃冰箱内1.5h，之后移入-80冰箱内过夜降温，最后将细胞置于液氮内，-196℃长期保存。

5.细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速投入到37℃水浴中，并反复摇动冻存管，使之复温，在超净工作台下吸出细胞悬液放入离心管理，1000g离心5min，弃上清，用培养液重悬后，再次离心重悬，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种于培养瓶内，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养。

在成纤维细胞培养过程中，不管是原代培养还是传代培养，不管是细胞冻存还是细胞复苏，以及后续的各种细胞实验，对细胞浓度和活率的检测都是最基础的工作，也是后续所有实验的前提。Countstar Rigel全自动荧光分析仪是一款基于图像法检测、配合多荧光通道，通过采集图像中的细胞信息，进行定量分析。它将荧光显微成像与统计学群体分析结合于一身，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供细胞形态学信息。

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