细胞治疗行业空间灭菌方法选择的新趋势
发布日期：2018-11-27 14:03:00浏览次数：7198
--干法移动式过氧化氢空间灭菌
我们国家从去年开始接受了CAR-T的新药申报，目前已经有二十几家企业申报了CAR-T的临床试验，这意味着CAR-T的产业化发展迎来了春天，CAR-T的工艺研究也必将百花齐放。现在的CAR-T工艺（图1），大体流程都是从患者体内的采血，把血样运输到生产的GMP中心，进行细胞的激活，慢病毒转染以及细胞的扩增、最终制剂生产和质量放行，最后再回到医院回输给患者。CAR-T作为一个全新的，革命性的技术正处于飞速发展阶段，不断有新的思路及新的技术进入该领域，人们对它的科学认识也在不断深入，随着CAR-T的制备工艺的提高，对它制备过程风险及质量控制要求也在不断加强。
图1. CAR-T制备工艺
与传统无菌制剂空间灭菌相比，CAR-T制备车间对无菌要求会更高，所有的核心操作区均要求B+A的环境，其对空间灭菌需求有其自身的特点（图2）：
图2.CAR-T制备车间空间灭菌需求特点
一、空间灭菌的现状
目前，我国在制药工业洁净区空间灭菌方法上还有很少的企业在用甲醛熏蒸法和臭氧熏蒸法，众所周知，甲醛杀菌能力不容置疑，但其属A类致癌物质，且易燃，其蒸汽对眼睛，呼吸道及皮肤有强烈刺激性，浓溶液可使皮肤凝固性坏死。欧盟，美国，日本等国家和地区已经出台相关法规，明确规定禁止使用甲醛熏蒸用于药品生产车间。而臭氧的杀孢子能力不行，且10PPM就使人昏阙，其材料兼容性比较差，特别容易使一些塑料及橡胶制品老化变硬。随着2010
GMP修订版的执行，以及美好中国建设对环保提出的新要求，同时生物制药的快速发展，传统空间灭菌方法已不能满足时代的需求，寻找能够取代甲醛和臭氧消毒的方式已刻不容缓。20世纪80年代，气化过氧化氢已被证明在较低浓度就具备杀灭孢子的能力，30多年的发展，过氧化氢灭菌工艺已经非常成熟，重复性好，易验证，已成为各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范所推荐的方法。
图3.不同灭菌方法对比表
1. 过氧化氢灭菌系统的分类
按过氧化氢蒸发原理的不同，可以分为两大类（图4）：
图4.过氧化氢灭菌系统分类
2. 干法过氧化氢灭菌与湿法过氧化氢灭菌的对比
下图从除湿、相态、渗透性、程序开发四个方面对干法和湿法过氧化氢灭菌进行了对比（图5）。
图5.干法与湿法过氧化氢灭菌对比
3.什么是干法移动式过氧化氢灭菌？
干法移动式过氧化氢灭菌的特点主要体现在“干”上面，“干”是指干的工艺（图6），能使液态过氧化氢完全气化，并实时监控灭菌区域的相对湿度，严格控制在饱和湿度值以下，避免过氧化氢在物体表面结露，大大降低腐蚀的风险，并有广谱的生物学效应，对细菌孢子、繁殖体、病毒、真菌、支原体等都能达到6log无菌保证水平。移动式主要体现在它的灵活性上，它既可以通过组合的方式对大空间进行一次性灭菌，又可以通过单台灭菌系统对不同的细胞制备核心功能区进行一对一灭菌，而不影响相邻功能区的正常使用。
图6.干法工艺图
二、如何保证干法移动式过氧化氢的灭菌效果？
首先，需要保证灭菌区域温度环境的均匀性。因为环境的温度不均匀，可能会造成灭菌气体在表面产生凝结。一般温度+/-2.5℃是能被接受的范围。需要注意的是那些环境中的高温表面，例如，冻干机、灌装机等设备的CIP/
SIP功能，会造成局部表面的高温，需要待这些位置冷却（一般低于40℃）才能进行过氧化氢灭菌。另外，高温会由于热辐射改变环境中气流的状态，使得局部的过氧汽化气体无法到达这些部位。
其二，控制灭菌区域的初始相对湿度。若灭菌区域的初始相对湿度过高，环境能容纳和吸收的水分只需很少就能达到饱和，这就使灭菌过程越容易产生凝结，气态过氧化氢浓度会降低，影响灭菌效果。湿度的均匀性会受温度均匀性影响，温度高的表面相对局部的湿度也会偏低一些。
第三，过氧化氢的用量是灭菌过程中较为可靠也是较为可控的参数。因此过氧化氢的总用量对于灭菌的效果而言是关键参数，灭菌区域体积确定的情况下，过氧化氢的用量是灭菌效果的重要考量因素。
第四，保证环境中过氧化氢的浓度。在灭菌过程中，过氧化氢本身在不断产生，同时也在不断分解。维持过氧化氢浓度在一定的水平是大多数灭菌系统厂家的做法，目前大多使用电化学的过氧化氢浓度传感器作为检测手段，但作为干法工艺的代表---德国PEA过氧化氢灭菌系统采用的是电容式过氧化氢浓度传感器，其自动加热功能可以避免过氧化氢在传感器表面产生结露，从而使测量更精确，该电容式过氧化氢传感器厂家在国内设有校准实验室。但是需要注意的是，空间中的过氧化氢浓度并不能直接说明灭菌效果的好坏。但是作为一个灭菌循环的参数，检测其浓度却是必须的，可以通过浓度的数据分析灭菌循环中的问题。
第五，灭菌维持时间也是需要考虑的因素，一方面要有一定的时间让过氧化氢气体扩散和接触，另一方面不同灭菌空间布局，用量不同，维持的时间长短也不一样，这需要在灭菌前进行参数开发。
第六，需要研究灭菌区域的空间布局，装载情况，确定移动式过氧化氢发生器以及分布器的位置，确保过氧化氢的分布无死角，前期的参数开发非常有必要。
第七，判断是否达到灭菌效果的唯一标准是生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC
12980或ATCC
7953（数量级≥1.0×106），培养箱[55℃-60℃]，培养7天，结果无微生物生长证明达到6log灭菌效果。
三、干法移动式过氧化氢灭菌应用实例分析
早在2013年3月，上海市质量技术监督局就发布了上海市地方标准《临床细胞治疗技术平台设置基本要求》，明确提出临床细胞制备室应采用专用的消毒灭菌（灭活）系统；不同类型细胞的制备应分别设置专用的工作用房；在更换不同种类细胞和不同来源细胞时应进行原位灭活清场，以避免交叉污染。为了及时有效的为CAR-T制备车间进行空间消毒，防止发生交叉污染风险，干法移动式过氧化氢灭菌技术越来越多的应用到CAR-T制备工艺中的空间除污染。
下图（图7）是某CAR-T制备机构的布局图（局部），该机构制备功能区由11组空调系统控制，功能性房间多达70多间，每个功能性房间面积大概20㎡，且相互独立，并且有70多套净化传递窗。对于功能性房间灭菌，不要求一次性灭菌，可以独立的分开灭菌，灭菌频次每个月1到2次；对于净化传递窗，可能需要一次性灭5-6台，几乎每天都会灭菌；基于这样的需求，该机构采用三套干法移动式过氧化氢灭菌系统，每套系统可以同时对相邻两组净化传递窗（图8）进行灭菌，三套干法移动式过氧化氢灭菌系统在45分钟内可以一次性灭6组净化传递窗，同样，三套干法移动式过氧化氢灭菌系统移动到各功能区可以一次性灭三个相互独立的不同功能性房间，大大提高了过氧化氢灭菌系统的使用效率，降低了购买设备的成本。
图7.CAR-T制备功能区布置图（局部）
图8. 同时灭相邻两组净化传递窗
为了CAR-T细胞制备机构在制备过程中避免污染、交叉污染、混淆及差错，且保证CAR-T细胞制剂的安全性、生物学效应，中国医药生物技术协会今年也发布了《CAR-T细胞制剂制备质量管理规范》征求意见稿，其进一步明确了CAR-T制备场所的要求：CAR-T细胞制剂制备场所分为洁净区及非洁净区。洁净区各功能区包括细胞制备区、细胞储存区、病毒制备区、病毒储存区、中控区、部分质控区（无菌检测室、微生物限度室、阳性对照室、细胞操作室等）等，各个区域相互独立，病毒制备区、病毒储存区、阳性对照室应具有独立的空调系统。非洁净区包括部分质控区（革兰氏染色、内毒素测定、流式细胞仪检测等）、留样室、办公室、资料档案室、物料储存室、气体储存室等，不应与洁净区交叉过往。
