细胞计数系列【2】MSC细胞培养与细胞计数

发布日期：2022-07-18 09:14:47浏览次数：2694

MSC细胞

MSC细胞（Mesenchymal Stem Cells）即间充质干细胞，来源于发育早期的中胚层，是多能干细胞中的一类。MSC细胞主要存在于结缔组织和器官间质中，骨髓组织中含量最为丰富。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

图1.MSC细胞明场图（Rigel S2摄）

图2.MSC细胞荧光图（Rigel S2摄）

MSC细胞的特点

1、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

2、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。

3、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

4、面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。

图3.干细胞特点（摘自网络）

MCS细胞的临床应用

间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。其常见的临床试验包括：

1.组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤，肝脏损伤，脊髓损伤和神经系统疾病。

2.作为基因治疗的载体。

3.造血干细胞移植：增强造血功能，促使造血干细胞移植物的植入，治疗移植物抗宿主病。

4.自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。

MSC细胞临床研究的优势

1、胎盘和脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。

2、免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。

3、干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。

4、扩增时培养体系能统一，便于质控。

5、可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。

6、潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。

7、采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。

8、采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。

MSC细胞的原代培养

以骨髓间充质干细胞为例

1、骨髓取样。

2、将骨髓样品放入离心管内，1000rpm离心5min,弃去脂肪和上清。

3、Percoll分离液法分离单核细胞：在15毫升离心管中加入5毫升Percoll分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，不要让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2:1，将离心管以2000rpm离心20min，离心后管内物质分为三层，用吸管吸取中间的白膜层置于新的离心管内。

4、在含有白膜层的离心管内加5毫升培养基，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min,之后弃去上清液，加入完全培养基，轻轻吹散细胞10-20次，制成细胞悬液。

5、计数细胞浓度，进行接种，以6×104/ml的细胞浓度接种于6孔培养板中，1ml/孔。

6、将其放置5% CO2、37℃、95%湿度培养箱内培养，24h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每3天换液1次。

图4. 贴壁培养的骨髓间充质干细胞（摘自网络）

细胞计数

在MSC细胞培养的整个过程中，都需要对细胞进行浓度和活率检测，Countstar Rigel全自动荧光分析仪是一款基于图像法检测、配合多荧光通道，通过采集图像中的细胞信息，进行定量分析的智能系统。它将荧光显微成像与统计学群体分析结合于一身，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供细胞形态学信息。它结合AO（丫啶橙）和PI（碘化丙啶）两种核酸染料，通过荧光染色和图像识别法对细胞浓度和活率进行精确计数（如图5），有效地排除细胞碎片和杂质的干扰（如图6），并可提供多种导出格式（如图7），得到非常稳定的结果（如表1），是MSC细胞培养过程中的好伙伴。

图5. AO/PI活率检测原理

图6. Countstar Rigel 分析仪检测的MSC图片

图7. Countstar Rigel 分析仪导出的图片结果（MSC）