细胞杀伤功能和效应检测方法概述

发布日期:2019-08-16 10:49:00浏览次数:197

杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面,免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞,如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T细胞(CTL)、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。近年来,细胞治疗行业蓬勃发展,尤其是肿瘤免疫治疗取得了极大的进展,在这些研究中,评价免疫杀伤细胞的有效性非常重要,细胞杀伤实验也成为免疫治疗研究中必不可少的实验方法。下面对目前用的比较多的细胞杀伤的方法进行综述。

51Cr同位素释放法

51Cr释放法是测定细胞杀伤功能最经典的方法,原理:铬酸钠(Na251CrO4)能进入到增殖的细胞内,与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后,即可释放出51Cr51Cr辐射γ射线,通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr,即可计算出细胞的杀伤能力。本方法一直以来被认为准确、重复性好。但也存在以下不足之处:51Cr有放射性,不利于安全操作和废物处理,且需要特殊特定仪器,成本也比较高;51Cr半衰期短(27.8天),无法用于需多次测定的动物实验;③细胞共孵育时间短,且实验操作步骤多,不能在单个细胞水平进行测定;④只能定性分析,无法定量等。

MTT还原法

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。通过测定靶细胞代谢活性的减少来来反映效应细胞所致的靶细胞的死亡。此方法的优点是简单易操作,无需标记靶细胞,可以高通量实验,同时还可以测量细胞增殖活性。缺点是此方法为间接法,与细胞状态关系比较大,容易出现假阴性;如果样本有微生物污染则可导致假阳性结果。

LDH释放法

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一,在正常情况下,不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时,LDH可以透过细胞膜释放到培养基中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中,使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2),后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物,在490nm或570nm波长处有一高吸收峰,利用酶标仪读取的OD值,即可测得杀伤细胞的活性。此方法属于间接法。虽然方法比较简单,可测的通量比较高,成本也相对比较低。但是也存在许多不足之处,例如,①如果存在效应细胞状态不好,会出现数据重复性不好,数据结果不稳定,这个细胞状态与个体差异及冻存复苏等均有比较大关系;②LDH可能存在部分自发释放现象,导致结果出现假阳性等。

报告基因转染法

利用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)或荧光素酶(luciferase, luc)基因转染靶细胞,建立稳定转染靶细胞系, 以此测定细胞杀伤效应。通过测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞死亡数目), 便可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分率。本法优点在于:①灵敏度高, 自发释放背景低;②用不同报告基因转染的细胞系可同时测定杀伤效应, 结果互不干扰;③用不同的基因调控元件(如组织特异性的或活性可诱导的启动子)控制报告基因的表达,可进一步进行深入机制研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力,这样会导致实验效率和周期变长,存在转染效率不高等因素影响,不利于生产。

荧光测定法

荧光测定法例如alamarBlue一步荧光测定法、Calcein-AM荧光扫描测定法等,alamarBlue与Calcein-AM均属于活细胞染料,只能在活细胞中发生作用并产生荧光信号。此方法的特点是特异性高、重复性好,还可以在荧光显微镜下直接观察细胞。但是不足之处是Calcein-AM对于某些高核浆比的细胞染色效果不太好,且在高浓度时可能会损害细胞;alamarBlue法检测灵敏度与孵育时间关系比较大,细胞浓度过高或者孵育时间过长会产生继发性还原反应,产生无色和荧光消失。但是也同样存在靶细胞状态不稳定时造成的结果不稳定及检测不够灵敏的问题。

EUTDA细胞毒法

51Cr释放法形式类似, EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标记靶细胞。BATDA能迅速进入细胞,并在水解作用下形成亲水的TDA留在细胞内,并在靶细胞裂解下释放,和相应试剂相结合形成强荧光、稳定的螯合物EuTDA用于检测。相当于同位素释放方法的替代法,该方法灵敏度高,且更安全。相较于无法区分非特异死亡的LDH检测,EuTDA法不受效应细胞死亡和裂解的影响,降低背景的同时提升了检测的窗口和稳定性。相较于Calcein,BATDA能有效标记脆弱细胞,迅速被细胞摄取和在细胞裂解下完成高效的释放,为ADCC检测提供了稳定的检测窗口和易于标准化等优势。

流式细胞法

流式细胞法包括PE-mAb/FITC-Annexin V荧光标记法、DIOC18/PI荧光标记法、PKH-26/CFSE荧光标记法等。PE-mAb/FITC-Annexin V荧光标记法原理是利用流式细胞仪将PE结合的效应细胞特异的单克隆抗体标记的效应细胞、非标记的靶细胞及FITC-AnnexinV标记的早期凋亡细胞分群,即可计算出效应细胞杀靶细胞的百分比,本方法简单快速、无需预标记。DIOC18/PI荧光标记法原理是DIOC18标记细胞膜,PI标记效应细胞核死亡靶细胞,通过流式分析区分两类细胞,优点是不需要活化靶细胞。PKH-26/CFSE荧光标记法原理是利用双标法有效标记和区分靶细胞,优点是自发荧光低。以上方法,需要找到合适的细胞类型和实验目的,不适用与广谱细胞杀伤实验检测,实验者也同时需要评估细胞生存力、荧光强度、荧光峰值的变异系数、染色均一性等;同时流式细胞仪操作也需要专业的操作人员,相对比较繁琐。

IncuCyte检测法

IncuCyte是一套用于长时间动态、非伤害式的活细胞成像分析平台。通过显微拍照,对培养的细胞进行连续监测。其优点是:①培养的细胞用显微镜直接监测,为非破坏性的监测;②监测过程中细胞无需离开培养箱,不用担心培养条件的改变对细胞状态的影响;③可在实验室外对细胞进行长时间监测等。但此方法也存在不可忽视的弊端,即不同的靶细胞生长速度及形态大小不同,若要同时进行多种靶细胞的检测,便需要对所检测靶细胞进行预实验,从而选出最佳种板靶细胞数;定量分析结果准确度受细胞状态影响比较大;该方法也是通过细胞增殖结果间接反映细胞杀伤的数据,灵敏度有一定限制,设备价格昂贵。

Countstar Rigel效应细胞毒性检测法

检测原理:Countstar Rigel全自动荧光细胞分析仪基于图像法检测,配合多荧光通道,采集细胞图像信息,进行定性和定量分析。本实验利用CFSE染料标记靶细胞,然后将靶细胞与效应细胞按照一定的效靶混合,孵育一定时间后,加入hochest3342及PI染料,孵育30分钟后上机检测。最终可以得到不同颜色组合的细胞图片,从而区分靶细胞与效应细胞,获得活的靶细胞个数,通过与对照组对比得到细胞杀伤效率。如下图所示。

图1 Countstar Rigel效应细胞毒性检测法实验原理示意图

图2 Countstar Rigel效应细胞毒性实验数据图片


图3 不同效靶比的细胞杀伤结果荧光图片


本方法核心检测结果是细胞杀伤后得到活靶细胞浓度,所以也可以通过CFSE和PI双染来实现细胞杀伤的数据。具体实验方法可根据用户实际需求来选择。

本方法的优点比较明显:

①  所需要检测的效应细胞量比流式法少,可节省细胞量;

②  检测成本相对比较低;

③  可以清晰观察到细胞图片,实验结果更加直观;

④  本方法可直接得到靶细胞杀伤的结果,避免间接法中效应细胞状态差异带来的误差。

以上细胞毒性效应测量方法均是目前大家在使用的方法,大家可根据自己实际的需求来选择最适的实验方法,从而达到更加可靠的实验结果。