CHO细胞简介与细胞计数

发布日期:2019-06-06 10:53:16浏览次数:252

CHO细胞基础知识介绍

01.CHO细胞简介

CHO细胞(Chinese Hamster Ovary),全称中国仓鼠卵巢细胞,是1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一只成年雌性中国仓鼠卵巢分离获得,为上皮贴壁型细胞,是一种非分泌型细胞,经多次传代筛选后,也可悬浮生长。由于该细胞具有不死性,可以传代百代以上,本身很少分泌内源蛋白,因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利,成为生物工程上广泛使用的细胞。它可形成有活性的二聚体(像白介素2等),具有糖基化的功能(如EPO),也让CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。该细胞存在遗传缺陷,无脯氨酸合成基因,不能将谷氨酸转变为谷氨酸-半醛,所以培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。

02.CHO细胞表达蛋白的优点

①能够准确地进行转录后修饰功能,表达的蛋白产物不论在分子结构、理化特性还是生物学功能方面都接近于天然蛋白分子;

②具有产物胞外分泌功能,有利于对下游产物进行分离纯化;

③可以高效扩增和表达重组基因;

④CHO细胞属于成纤维细胞,很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的分离;

⑤具有贴壁生长特性,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达水平较高;

 ⑥能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养,可以大规模生产。

03.CHO细胞研究历程

①1919年北京协和医学院的胡正祥教授最早在北京使用中国地仓鼠研究肺炎球菌;

②北京协和医学院的美国科学家Jocelyn Smyly和Charles Young发现中国地仓鼠很容易感染寄生虫利什曼原虫从而引发黑热病,这成为利用中国仓鼠进行流行病学研究的开端。

③1948年,20只中国地仓鼠被运到纽约的试验动物专家Victor Schwentker实验室。

④1957年,Dr. Theodore T. Puck从一只雌性中国地仓鼠卵巢中成功分离了CHO细胞株,由于该细胞快速悬浮生长和高蛋白表达的特性,CHO细胞开始在科研和企业获得普遍的应用。

⑤1984年,Genentech公司首次实现重组中国仓鼠卵巢细胞表达组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)并于1987年成功获批上市,成为哺乳动物细胞表达系统生产蛋白药物的一个标志性事件。

⑥1986年以后,科学家逐渐成功分离出的不同亚型的CHO细胞株,比如CHO-S,CHO DXB11,CHO DG44,CHO-M以及近年来受到持续关注的GS基因敲除的CHO细胞。⑦2011年,Xu及其工作伙伴完成第一个CHO基因组测序,显著加速了生物技术在研究成果上的应用。

⑧经过60年的发展,CHO细胞系出现了多种成熟的商业化产品,主要包括龙沙公司的CHO K1SV、CHO K1SV GS-KO,西格玛公司的CHOZN DHFR-/-、CHOZN GS-/-,赛默飞公司的CHO-S、CHO DG44,ATCC公司的CHO/dhfr-、CHO K1等细胞系。

04.CHO细胞培养生产单克隆抗体的工艺流程

05.CHO细胞培养过程中的关键因素

1.培养基

基础培养基:主要是细胞培养的初期用于细胞的繁殖和生长阶段。

补料培养基:可以用于细胞繁殖的早期和代谢产物的表达阶段。

市场上CHO细胞的培养基有商品类和定制类两种,后者用于特殊培养。

优化方式:

①选用多种商品类培养基进行组合混料实验,根据CHO细胞培养的情况来选出较好的组合混料培养基。

②选用固定的培养基并向其中添加微量元素、氨基酸、生物因子及维生素等物质,通过培养实验结果得出对CHO细胞培养影响最大的物质,然后再有针对性地进行培养基的优化处理。
③根据CHO细胞的情况来分析CHO细胞生长繁殖过程中和代谢表达过程中所需的营养物质和限制因子,然后进行针对性的添加或去除,从而达到优化培养基的目的。

优化步骤:小规模实验优化→培养工艺放大对优化进行验证→确定最终培养基。

2.培养参数

①温度:在CHO细胞培养中变温培养应用最为广泛,在CHO细胞的生长繁殖阶段和代谢产物表达阶段的温度控制在不同的范围内,在繁殖的后期阶段将温度降低以延缓CHO细胞的死亡来提高代谢产物的表达量。

②溶氧气情况:CHO细胞培养多采用搅拌式的反应器,在搅拌的过程中实现细胞生长代谢对氧气的需求,同时有效去除多余的二氧化碳(CO2)以实现细胞培养的有效进行。

③其他:培养环境酸碱度、渗透压等。

④保护措施:添加聚醚F68可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤,或用0.05%或0.075%的500 kDa的γPGA替代F68。

3.培养过程中常见问题

①构建的重组CHO细胞生产效率低,产物浓度也低;

②某些糖基化的表达产物不稳定,不容易被纯化;

③CHO细胞上游构建时着重考虑它的高效表达,而对产物能否有效地提取出来考虑较少,导致上游构建与下游分离纯化脱节;

④重组细胞培养费用昂贵,自动化水平低下。

细胞计数

在CHO培养生产抗体的整个过程中,都需要对细胞进行浓度和活率检测,Countstar Altair全自动细胞分析仪利用台盼蓝排斥方法,结合先进的光学成像技术和智能图像识别技术,一步操作即可获得细胞总数,浓度,活率,直径,结团率等信息。

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3.1  JPEG格式


图3.2 EXCEL格式

图3.3 PDF格式

小结

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(PS: 仅限于研究用途, 不可用于诊断操作)