皮肤成纤维细胞的培养和细胞计数

发布日期:2019-04-12 17:27:47浏览次数:135

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成纤维细胞简介

成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要组成成分,它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的,胞体较大,为多突的纺锤形或星形的扁平细胞,胞质弱嗜碱性,细胞核较大,呈椭圆形,染色质疏松,着色浅,核仁明显,细胞轮廓不清,具有突起。成纤维细胞能够分泌少量的细胞生长因子,也能合成和分泌胶原蛋白和弹性蛋白,生成诸如胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等细胞外基质成分。成纤维细胞容易培养,取材也非常便利,容易受基因修饰,所以它常常有不同的应用:

(1)作为基因修饰的受体细胞应用于细胞核移植、基因表达等方面;

(2)作为多种干细胞如胚胎干细胞(ES)和神经干细胞(NSC)等细胞培养的饲养层,其分泌的细胞因子可维持干细胞的未分化状态;

(3)可作为研究机体内源性逆转录病毒体外和体内感染性的细胞模型;

(4)利用成纤维细胞大量增殖的特性,可用于机体创伤修复包括一般创伤修复和骨创伤修复。


02

细胞培养

1.取材:采集机体皮肤,放入含有双抗(100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)的无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS),反复洗涤多次,剪除毛茬,去除血污、脂肪和结缔组织,保留真皮层,用眼科剪将皮肤剪成3~4mm的碎片。

2.原代培养

a.胰酶消化法:将皮肤组织块用眼科剪剪碎后,加入适量含有0.02%EDTA的0.25%的胰酶进行消化,置于37℃水浴锅内,每隔10min左右吹打摇晃一次,30min后,用100目过滤网滤掉组织块,将细胞悬液1000g离心5min,去除上清液,用培养液重悬细胞,再次离心重悬后,调整细胞密度至1~5×105个/mL,接种于75mL培养瓶内,放入37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养,每2d换液1次。细胞培养液为含10%胎牛血清(FBS)和1%双抗的DMEM培养液。

b.组织块贴壁培养法:将细碎的组织块接种于75mL培养瓶内,均匀铺于瓶底,皮块之间相距1cm,翻转培养瓶,使瓶底向上,置于37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养2h,使皮块略微干涸。之后,放正培养瓶,使瓶底向下,加入适量培养液,覆盖瓶底,放入培养箱内进行培养,每2d换液1次,并观察细胞贴壁情况。

3.传代培养:当细胞长到80%~90%汇合度时,开始进行传代培养。吸出培养瓶里的培养液,用已在37℃预热的无钙镁离子的PBS溶液(DPBS)里洗涤3次,去除细胞碎片和残余血清,然后用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶在37℃消化2min,观察贴壁细胞变圆时,加入含胎牛血清的培养液终止消化,并用移液器吹打,使细胞脱落,吸取细胞悬液,1000g离心5min,重悬离心2次后,调整细胞密度至1~5×105个/mL,接种于培养瓶内继续培养。

4.细胞冻存:冻存液的配制比例为DMEM: FBS: DMSO=7:2:1。按照传代培养方法对细胞进行消化,离心,去上清液后,用冻存液重悬细胞,调整细胞密度为1~2×106个/mL,取1mL细胞悬液置于1.8mL冻存管内,密封冻存管,并标上细胞类型和冻存时间,将冻存管在4℃冰箱放置30min后,移入-20℃冰箱内1.5h,之后移入-80冰箱内过夜降温,最后将细胞置于液氮内,-196℃长期保存。

5.细胞复苏:将冻存管从液氮中取出,迅速投入到37℃水浴中,并反复摇动冻存管,使之复温,在超净工作台下吸出细胞悬液放入离心管理,1000g离心5min,弃上清,用培养液重悬后,再次离心重悬,调整细胞浓度为1×106个/mL,接种于培养瓶内,置于37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养。

03

细胞计数

在成纤维细胞培养过程中,不管是原代培养还是传代培养,不管是细胞冻存还是细胞复苏,以及后续的各种细胞实验,对细胞浓度和活率的检测都是最基础的工作,也是后续所有实验的前提。Countstar Rigel全自动荧光分析仪是一款基于图像法检测、配合多荧光通道,通过采集图像中的细胞信息,进行定量分析。它将荧光显微成像与统计学群体分析结合于一身,既能提供细胞群的统计数据,又可以获得单个细胞的图像,从而提供细胞形态学信息。

它的核心优点有:

1.应用广泛化

  Rigel S2系统使用双色荧光,能够染色活的和死的有核细胞,即使存在碎片、血小板和红细胞,也能产生准确的活率结果。针对来自外周血、脐带血、骨髓和其他复杂样品的原代细胞,能够进行有效的细胞计数、活率检测、浓度分析。可用于各种研究领域,适用于浓度范围为1×104~3×107/mL,直径3um-180um大小的所有细胞,包括全血中的有核细胞、PBMC、脾细胞、干细胞、T细胞、NK细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、肿瘤细胞等。

2.操作智能化

(1)全触屏、一体化设计,个性化的APP操作平台,让你轻松检测细胞样品。如图1.

图1 个性化的APP

(2)同时可检测五个样品,每个样品自动采集三个视野并算出平均值,快速而便捷,如图2.1和2.2。

 

 2.1 同时检测5个样品     2.2 每个样品采集三个视野

(3)多种数据导出格式,包括JPEG、EXCEL、PDF等格式,根据实际需要导出各类结果,满足不同的目的,如图3.1、3.2和3.3。

图3.1  JPEG格式

图3.2 EXCEL格式

图3.3 PDF格式

3.测定结果精准化

   在细胞浓度范围2×105/mL~1.5×107/mL内,Countstar Rigel的浓度和活率测量差异CV小于5%,如图4.

图4.板与板之间、仪器与仪器之间、仪器结果与血球计数板结果比较

4.仪器本身合规性

(1)符合FDA 21 CFR Part11法规,有多级权限管理和电子签名等功能,如图5.1和5.2。

 

 图5.1多级权限管理      图5.2电子签名记录

(2)满足GMP规定,可以提供IQ、OQ、PQ验证服务

    Countstar产品是免维护的仪器,可以定期通过标准颗粒对仪器的稳定性和准确性进行校准,我们提供8种颗粒,包含3种浓度颗粒,3种活率颗粒以及2种直径颗粒,可以完成对仪器全方位的校准以及验证,确保仪器的性能符合要求,如图6。

图6. IQ、OQ文件,PQ验证标准颗粒

5.使用的便利性

仪器无需特殊维护,开机即可使用,不用预热;结束后即可关机,不用超长等待。检测样品只需要三步,加样→插板→检测,每个样本只需10mL,最低只需30s就可检测结束。如图7。

图7. 三步操

小结

   细胞的原代培养,细胞的传代培养,细胞药理性检测,细胞增殖活性检测,细胞杀伤能力检测等各类实验的开展,都要清楚地知道细胞的浓度和细胞的活率,以方便我们更好地进行传代接种、处理样本。细胞实验不仅需要我们娴熟的操作技巧,更需要我们精准的测定结果。Countsart Rigel全自动细胞荧光分析仪在细胞计数和活率检测、浓度分析上会成为你最可靠的朋友,陪伴你进行各类细胞实验,帮助你得到更加准确的结果,它是值得你选择的。