Countstar在细胞周期检测中的应用

发布日期:2019-03-20 15:53:22浏览次数:257

<简介>

细胞增殖分裂是细胞最基本的生理活动。生长因子、激素及癌基因产物等均可诱导细胞的增殖或抑制细胞的增殖,归根到底均是影响细胞周期的运行。细胞周期失控的超常快速运行,将导致癌瘤;停滞不前则常是细胞衰老、凋亡的前奏。

细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段。


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检测原理

细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G0/G1期具有二倍体细胞的DNA含量 (2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量 (4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色剂,常用于细胞周期分析,它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。根据DNA上结合染料的荧光强度来判断细胞周期的分布。



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实验步骤


  1. 样本准备:

  2. 每个样品收集约30-50万个细胞于1.5ml离心管内(如细胞密度为100万个/mL,则取500µl体积悬液用于后续实验);400g离心3-5分钟,沉淀细胞。小心吸除上清,加入约500µl冰浴预冷的PBS,重悬细胞,并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50µl左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

  3. 细胞固定:加入500µl冰浴预冷60%乙醇中,轻轻吹打混匀,4℃固定1小时或更长时间。

  4. 400g左右离心3-5分钟,沉淀细胞。可以残留约50µl左右的60%乙醇,以避免吸走细胞。加入约200µl冰浴预冷的PBS,重悬细胞。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

  5. 染色:每管细胞样品中加入100µl PI染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37℃避光孵育30分钟。

  6. PI染色液的配制:参考下表,根据待检测样品的数量配制适量的PI染色液:


  7. 混匀样品,并在30min内完成检测。


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结果分析









  • Countstar Rigel检测细胞周期图像

图示更直观,可以直接看到细胞状态和样品量;无需过滤除去细胞团,Countstar Rigel也可以准确进行定量。


  • FCS Express 6Image软件分析的细胞周期分布曲线

  1. DMSO组:空白对照,正常的细胞周期分布图;

  2. 诺考达唑-64nM:G0/G1期细胞明显减少,G2/M期细胞明显增多;

  3. 诺考达唑-100nM:细胞周期分布比例,G2/M期细胞占据90%。


  • Graphpad Prism软件分析获得剂量依赖曲线:

根据FCS Express 6 Image软件分析后结果获取各时期百分比,再用Graphpad Prism软件分析获得剂量依赖曲线,可得到该药物对细胞周期阻滞的IC50。



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结语


Countstar® Rigel是一个智能的、直观的细胞分析仪器用于多种细胞实验,包括细胞转染,细胞凋亡,细胞表面标志物,细胞活力,抗体亲和力和细胞周期的评估。该系统提供了强大的荧光定量结果。易于使用的自动化程序指导你完成从细胞图像采集到数据分析的过程。