Countstar在干细胞领域的应用
发布日期：2019-03-15 13:53:00浏览次数：2713
一、干细胞的研究背景
干细胞新疗法的不断出现，不仅给更多的疾病带来治疗新思路，也给市场的发展注入源源不断的驱动力。2018年，欧盟批准了脂肪来源间充质干细胞治疗产品Alofisel上市，适应症为克罗恩病患者复杂性肛周瘘。同年，我国申报受理了5款间充质干细胞治疗产品。此外，基于诱导多能干细胞的新型疗法也有多项获批进入临床试验。例如，去年日本批准了世界首个iPS细胞治疗帕金森的临床试验，又批准了世界首个基于iPS细胞的心脏治疗试验，2019年2月，日本批准了全球首例iPS细胞治疗脊髓损伤的临床试验。
在干细胞研究和转化应用快速发展的同时，也出现了一些问题，干细胞制备标准不统一，质量存在严重隐患，一些逃避政府监管、缺乏临床前研究数据的干细胞治疗屡禁不止。因此，国家卫生健康委员会制定了《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》，并发布中国第一个干细胞行业法规《干细胞临床研究管理办法（试行）》来规范干细胞临床研究，充分保护受试者的权益。因此，干细胞的临床研究不再是一个空白地带无人监管，而是有明确的法律文件进行指导和约束。
二、干细胞制剂与使用环节的难点
1.原代间充质干细胞分离后含有大量的杂质，从胎盘和脐带血中提取的原代细胞数量和质量难以控制；
2.传统方法冻存前干细胞活率判断粗略，并不明确细胞具体所处的生长周期和凋亡状态；
3.干细胞冻存前后和运输前后的活率，用台盼蓝染色法难以准确判断；
4.干细胞制剂或冻存干细胞的CD maker检测用流式检测工序繁琐、成本高昂；
5.缺乏一套简洁易行的放行检测方法和标准，以及实现质量鉴定控制的小型仪器；
6.目前以单个细胞为对象的质量监控方法主要有显微镜、流式细胞仪等，但是显微镜容易引入人为因素，造成检测结果不可控，另外，流式细胞仪的操作维护相对复杂，缺乏完成整个质控体系细胞质量检测的设备。
三、Countstar Rigel全自动细胞荧光分析仪在干细胞质量鉴定控制的应用
Countstar Rigel从研发、生产、质控、存储、临床等环节都可以应用，在制剂优化、培养基优化、CMC工艺验证、入库检、过程检、放行检、复核检等相关环节都能够充分发挥作用。对细胞计数和活率的检测基本所有质检环节都会使用，而且是入库检、过程检、放行检和复核检的必检项目。
在干细胞研究领域中，从干细胞复苏至最终用于研究，中间过程需要经历细胞传代及运输。因此细胞在整个过程中的质量变化对最终的研究结果有着至关重要的影响。细胞质量包括了浓度、活率以及细胞表型。Countstar Rigel AO/PI双荧光活率计数方法，可对刚复苏以及运输后的干细胞进行快速准确的活率、浓度测量，同时高灵敏度的光学系统，可精确，便捷的完成干细胞表型分析，以及生长周期和凋亡状态的分析。
表型分析：入库检和放行检的必检项目；
1.细胞凋亡：一般在过程检和复核检进行，非必检项目；
2.细胞周期：一般在过程检，作为内部质控，一般放行检不做，非必检项目；
3.新鲜样本：对运输冷链要求高，稳定性要求高，有的要求5h内回输，可存储时间24h之内，最长48h；
4.冻存样本：采用液氮运输，不限制运输方式，转移7天完全可行。空运-铁路-汽车都可使用，后续也可以放在液氮中继续保存，可以保证7天低温；
5.间充质干细胞在入库检和放行检都要检测表型，CD3、CD4、CD8也会检测，主要评估干细胞对免疫细胞的影响。
四、Countstar Rigel 全自动细胞荧光分析仪对干细胞的分析结果
1.Countstar Rigel对间充质干细胞的细胞活率分析
（1）Countstar Rigel提供两种（台盼蓝和AO/PI法）检测细胞的活率
运输后：细胞折光指数改变，台盼蓝染色不明显，难以确定细胞活率。AO/PI双色荧光可以对有核细胞进行染色，即使在有碎片、血小板和红细胞存在下也能精确地进行细胞活率测试。
（2）AO/PI荧光染色法对细胞死活进行鉴定更为灵敏
台盼蓝测试活率对于状态好的细胞测试结果比较准确，对于状态不好的细胞（运输后），测试结果与AO/PI法相差较大。AO/PI的方法能更为灵敏的反映细胞状态的差异
2.AO/PI荧光染色法对细胞死活进行鉴定更为灵敏
Control为未经任何处理的间充质干细胞；treatment为经58℃水浴3min的同浓度间充质干细胞。经过热水浴物理凋亡的间充质干细胞活率降低，凋亡细胞数量增多
3.Countstar Rigel对间充质干细胞的细胞周期分析
间充质干细胞细胞周期检测结果
4.Countstar Rigel对间充质干细胞CD marker检测结果
培养中的间充质干细胞CD maker检测结果
五、Countstar Rigel全自动细胞荧光分析仪在干细胞检测中的优势
1.AO/PI荧光染色法可对细胞死活进行明确检测；
2.20μl完成检测，细胞和试剂耗费少，成本低；
3.CD maker检测简捷快速，无需流式专人维护、无需清洗养护；
4.可输出流式聚类分析结果，与流式检测法可验证可对比；
5.精细到单个细胞的图像和参数输出，让计数结果清晰可见；
6.小巧便捷，让放行质检和回输前质检采用同一标准成为可能；
7.按照GMP、cGMP和FDA数据存储、用户管理、电子签名要求的规范设计，保证信息来源可靠、可追溯，可提供GMP认证相关3Q验证服务；
8.可通过局域网连接服务器，实施上传检测结果，数据更安全；
9.应用点综合性：可用于干细胞的计数、活率、周期、凋亡、表型分析。
六、Countstar Rigel全自动细胞荧光分析仪应用举例：
1.Countstar Rigel可应用于干细胞制剂存储前后的细胞浓度和活率的检测；
2.可用于脐带血运输前后细胞质量检测，使用AO/PI法计数，可以更精确地进行细胞浓度和活率的检测；
3.干细胞冻存检测保种质量控制：检测从胎盘和脐带中提取的原代细胞的浓度和活率；冻存前干细胞CD marker检测；冻存前干细胞生长周期和凋亡状态判断；
4.干细胞制剂的放行质控体系：Countstar Rigel的软件和文件系统符合GMP要求；最大限度避免在QC阶段引入人的主观因素；质控体系使用的必须是小型化的一体多功能检测机器，Countstar Rigel适用于整个链条；质控体系前、中、后期必须采用同样的设备和标准，需要保证各机器间的一致性和可验证，Countstar Rigel可通过局域网连接服务器，实现多台仪器检测数据的实时上传。